野生稻過氧化物酶分離純化

導讀:上海安亭科學儀器廠離心機在野生稻過氧化物酶分離純化的過程中的應用，并檢測POD的酶學特性，從而進一步研究野生稻抗逆生理尊定基礎。

來源：未知發(fā)布日期：2019-12-20 10:59【大中小】

上海安亭科學儀器廠離心機在野生稻過氧化物酶分離純化的過程中的應用，并檢測POD的酶學特性，從而進一步研究野生稻抗逆生理尊定基礎。

植物體內(nèi)含有多種POD同工酶，其同工酶譜和酶的活性在不同組織器官和不同生長發(fā)育期內(nèi)有較大變化，在植物生長、發(fā)育和逆境適應性反應中發(fā)揮重要作用。植物體內(nèi)存在不同POD同工酶，POD表達和活性與植物的抗逆性密切相關。東鄉(xiāng)野生稻是迄今為止世界上自然分布最北的冬天能越冬的野生稻，能耐受-8.5℃的極端低溫，具有卓越的抗寒抗逆特性，是中國寶貴的野生稻種資源。筆者前期研究表明東鄉(xiāng)野生稻POD的活性在不同發(fā)育時期和環(huán)境脅迫下存在著差異。為深入研究東鄉(xiāng)野生稻過氧化物酶的功能和及其抗逆生理作用，本研究上海安亭科學儀器廠采用鹽析沉淀、柱層析方法和活性電泳對東鄉(xiāng)野生稻的過氧化物酶進行純化和鑒定，并檢測POD的酶學特性，從而為進一步研究東鄉(xiāng)野生稻抗逆生理奠定基礎。

1主要試驗儀器
UV2600紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；CR22GⅡ型高速冷凍離心機（Himac，日本）；JA5003上皿電子天平（上海精科天平）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器）；多功能直射凝膠電泳系統(tǒng)（BIO-RAD）；核酸蛋白檢測儀HD21C-B（上海康華生化儀器制造廠）；TH-500A梯度混合器（上海滬西分析儀器廠）；LM17型色譜記錄儀（永青示波器廠）

2.POD分離純化
（1）粗酶原液制備將所取水稻葉片用蒸餾水洗凈、濾紙拭干、稱重、剪碎后，置于預先冰浴冷卻的小研缽中，按照W/V=1:2比例加入酶提取液（40mmol/LpH6.0磷酸緩沖液）。冰浴研磨成勻漿后，4層紗布過濾，10000r/min離心20min，取上清液，上清液即為粗酶液，放入4℃冰箱中備用。

（2）粗酶原液的硫酸銨鹽析與透析采用硫酸銨(NH4)2SO4分級沉淀法提取POD酶，粗酶液中緩緩加入硫酸銨使其達到20%的飽和度，同時輕輕攪拌，4℃條件下靜置一段時間后，10000r/min離心20min，收集沉淀，加入少量提取緩沖液溶解沉淀備用。重復上述步驟，繼續(xù)加入硫酸銨，使得樣品液中的硫酸銨飽和度依次達到40%、50%、60%、70%和80%時，分別收集沉淀，用等體積提取緩沖液溶解沉淀。各樣品液進行透析脫鹽處理，測定蛋白含量和POD酶活力，計算比活力，從而確定沉淀提取POD酶的合適初始分級硫酸銨飽和度，然后依據(jù)合適的初始硫酸銨飽和度批量提取粗POD蛋白。

3討論與結論
綜上所述，本文上海安亭科學儀器廠以東鄉(xiāng)野生稻葉片組織為材料，通過浸提、硫酸銨鹽析、透析和SephadexG-100凝膠柱層析等系列步驟，分離得到POD1同工酶，其比活力為568.80U/mg，POD酶蛋白的純化倍數(shù)為16.49。聚丙烯凝膠活性電泳檢測表明，純化得到了單一組分的東鄉(xiāng)野生稻POD酶蛋白。經(jīng)測定，POD酶Km為1.26mmol/(L·min)，最大反應速度Vmax為17.51mmol/(L·min)，最適宜的pH5.0，最適宜溫度35℃~45℃，Cu2+和Zn2+對POD有較強的激活作用，而Fe3+對POD活性有一定的抑制作用，POD酶活性受甲醇、乙醇和丙酮等有機試劑抑制。研究表明，過氧化物酶與植物生長密切相關，過氧化物酶是植物體內(nèi)活性氧酶促防御系統(tǒng)的關鍵酶之一，在生物脅迫和非生物脅迫條件下均發(fā)揮作用，前期工作也發(fā)現(xiàn)東鄉(xiāng)野生稻體內(nèi)過氧化物酶的活性隨著生育期不同而發(fā)生變化，本研究進一步純化了東鄉(xiāng)野生稻POD酶并研究了酶的催化特性，為深入探討其在體內(nèi)生理功能奠定了基礎。

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野生稻過氧化物酶分離純化

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